Условно-патогенные бактерии в осадках сточных вод молочного производства

Введение. На предприятиях молочной промышленности образуются сточные воды (СВ) и их осадки, которые характеризуются высоким содержанием органического вещества, а также соединений фосфора и азота [1, c. 12; с. 148]. Данная группа веществ отличается высокой биологической активностью [1, с. 57-159]. Вследствие этого утилизация осадков в качестве потенциально ценного органоминерального удобрения в сельском хозяйстве является наиболее прогрессивным решением.

Это приведет к снижению дефицита органических удобрений и позволит перейти к экономически выгодному безотходному производству. Однако для применения осадков сточных вод (ОСВ) в таком качестве существует ряд ограничений. Содержание большого количества санитарно-показательных микроорганизмов, присутствие патогенной и условно-патогенной микрофлоры в составе СВ и ОСВ при использовании их в качестве удобрений является причиной микробиологического загрязнения объектов окружающей среды, нарушает нормальный состав почвенной микрофлоры, препятствует выращиванию на ней экологически чистой продукции, создает угрозу здоровью людей.

Традиционно для оценки эпидемической опасности объекта используют количество санитарно-показательных бактерий, которые отражают возможное содержание патогенных микроорганизмов. Однако данный показатель в большей мере применим к хозяйственно-бытовым СВ и не всегда достаточно коррелирует со всеми возможными патогенами.

Целью нашей работы явилось микробиологическое исследование состава условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, Staph. aureus и листерий ОСВ Березовского сыродельного комбината для оценки возможности использования ОСВ в качестве органического удобрения.

Методика и объекты исследования. Объектами исследования являлись сырые осадки сточных вод Березовского сыродельного комбината и микроорганизмы осадков.

Определение условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae проводили традиционным методом бактериологического анализа. Отбирали по 500 мл представительной пробы ОСВ в стерильную посуду. Из отобранных ОСВ готовили исходное разведение 1:10 в физиологическом растворе. В дальнейшем из отобранного материала готовились серии децимальных разведений по стандартной методике для посева на питательные среды. Из разведений ОСВ производили посев по 0,1 мл суспензии на поверхность плотной элективной среды Эндо.

Посевы инкубировались при 37±1°С в течение 24 часов. Следующий этап - отсев выросших колоний энтеробактерий на комбинированную среду Клиглер (по 3-5 однотипных колоний) для первичной дифференциации и накопления культуры. На заключительном этапе производили окончательную дифференциацию по комплексу биохимических признаков [4]. Было проведено 3 серии исследований.

Определение количества Staphylococcusaureus проводили методом без предварительного обогащения посевом на агаризованную селективную желточно-солевую среду (ЖСА) исследуемого материала или разведения его, инкубирования, подсчета типичных колоний с последующим подтверждением выросших колоний стафилококка по плазмо-коагулирующей способности и ферментации маннита аэробно и анаэробно [5].

При определении листерий использовали метод, основанный на высеве определенного количества исследуемого материала в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением), последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выявленных колоний к видам рода Zisteriaопределяли по биологическим свойствам [6; 7]. На первом этапе разведения ОСВ в пропорции 1:10 засевали в среду первичного обогащения (бульон Фрейзера) и инкубировали 24 ч при 30°С.

При росте листерий на полуконцентрированном бульоне Фрейзера, содержащем эскулин, отмечали почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскуле-тина. На втором этапе 0,1 мл культуральной жидкости переносили в среду вторичного обогащения - бульон Фрейзера нормальной концентрации и инкубировали 48 ч при 37°С. После обогащения культуры высевали на Оксфордский агар. Посевы инкубировали при температуре 37±1°С в течение 24-48 ч. Через 24 ч инкубирования отмечали рост листерий: мелкие колонии диаметром 1 мм, сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 часов - более темные, около 2 мм в диаметре с черным ореолом и углубленным центром. Исследование проводили в одну серию.

Результаты и их обсуждение. Для уточнения количества микроорганизмов производили перерасчет их количества на 1 г исследуемого образца ОСВ. Всего было выделено 7 видов бактерий сем.Enterobacteriaceaeво всех образцах ОСВ:^ coli, Kl. pneumonia s. pneumonia, Citr.feundii, Citr. diversus, Ent. cloacae, Pr. vulgaris,Morg. morganii. Видовой состав сем.Enterobacteriaceaeв разных сериях исследования образцов ОСВ представлен в таблице 1.

Во всех сериях исследований присутствовала E. coli и практически во всехпреоб-ладала количественно. Kl. pneumoniaes. pneumoniaприсутствовала в двух сериях из трех, и количество ее было значительно (до 10⁷). Дважды присутствовали в образцах ОСВ Citr. feundim Pr. vulgaris, по одному разу Citr. diversus,Ent. cloacae и Morg. morganii.

Важное значение имеет соотношение БГКП и бактерий E. coli. В нашем исследовании к группе БГКП относится пять видов:E. coli, Kl. pneumonias. pneumonia, Citr. feundii, Citr. diversus, Ent. cloacae. Суммируя их общее количество по сериям и деля на количество E. coli, получим значение отношения БГКП/ E. coli. Сравнивая полученные данные (1 серия - 2; 2 серия - 1,2; 3 серия - 1,05) с литературными значениями этого показателя для сточных вод (от 4 до 7 [9, с. 110]), можно сказать, что в исследуемых образцах ОСВ значение БГКП/ E.co^buro низким, что свидетельствует о фекальном загрязнении данного материала.

Это согласуется с тем фактом, что в процессе водоотведения на данном предприятии хозяйственно-бытовые воды смешиваются с производственными и направляются в одну систему очистки. Анализируя изменение отношения БГКП/ E. coli по сериям исследования, необходимо отметить снижение этого показателя (с 2 в серии 1 до 1,05 в серии 3), что говорит о нарастании эпидемической опасности ОСВ. Однако необходимо учитывать, что производственные сточные воды молочного производства являются высококонцентрированными стоками и могут быть питательной средой для развития многих микробов, в том числе и БГКП. Поэтому однозначно говорить об эпидемической опасности ОСВ нельзя.

Также и снижение значения БГКП/ E. гайпо сериям исследований, возможно, связано с сезонными изменениями температуры и созданием благоприятных условий для развития E. coli. Для того чтобы выяснить, является ли повышенное количество E. coli следствием свежего фекального загрязнения, необходимо провести исследования на термотолерантные кишечные палочки. Оно позволит сказать, являются ли выделенные^ coli фекальными формами. Это необходимо учесть в дальнейших исследованиях.

При определении стафилококков после термостатирования посевов на среде ЖСА в течение суток отбирали характерные или подозрительные на Staphylococcusau-reus колонии и отсевали их на поверхность скошенного питательного агара для накопления культуры. На среде ЖСА колонии St. aureusбыли окружены радужным ореолом за счет лецитиназной активности. У выросших культур проверяли отношение к окраске по Граму, определив грамположительные кокки. Проводили учет реакций плазмокоогу-ляции и ферментации маннита аэробно и анаэробно.

В первой серии исследований St. aureus не был выделен.

Во второй серии исследований золотистый стафилококк был обнаружен в количестве 10 КОЕ/г.

Полученный результат подтверждает мнение о невысоком содержании этого микроорганизма в сточных водах. В дальнейших исследованиях, учитывая небольшое количество St. Aureusв ОСВ, необходимо использовать метод культивирования с использованием среды обогащения.

Для определения листерий проводили исследование с использованием метода первичного и вторичного обогащения. На первом этапе разведения ОСВ в пропорции 1:10 засевали в среду первичного обогащения (бульон Фрейзера) и после суточного инкубирования при 30°Сотмечали рост листерий на полуконцентрированном бульоне Фрейзера, содержащем эскулин. Было зафиксировано почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета.

Проведение второго этапа - вторичного обогащения культуры в бульоне Фрейзера - осуществляли в течение 2 суток. После обогащения культуры высевали на Оксфордскийагар. Через 24 ч инкубирования отмечали рост листерий: мелкие колонии диаметром 1 мм сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 ч они становились более темными, около 2 мм в диаметре, с черным ореолом и углубленным центром. Отбирали отдельные колонии, выращенные на агаре, и пересевали бактериологической петлей на среду МПА с 1% глюкозы.

Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeriaу полученных чистых культур проверяли отсутствие капсул и спор, окраску по Граму, определяли присутствие каталазы (каталазную активность), подвижность бактерий при двух температурах инкубирования: (22±1) и (37±1)°С. Выделенные бактерии явились грам-положительными тонкими короткими палочками, каталазоположительны-ми,подвижными при (22±1)°С и слабоподвижными при (37±1)°С. Это позволило говорить о принадлежности их к роду Listeria.

Для видовой дифференциации листерий выявляли у выделенных культур ферментативные свойства (способность ферментировать углеводы на средах Гисса с применением маннита, ксилозы, маннозы и рамнозы), в-гемолитическую активность (способность образовывать зоны просветления за счет растворения эритроцитов под или вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара), ставили CAMP-test со St. aureus. Выделенные культуры были в-гемолитическими, CAMP-test соSt. aureus был отрицателен. Бактерии ферментировали ксилозу и маннозу и не ферментировали маннит и рамнозу. По комплексу признаков выделенные бактерии были отнесены к виду Listeriaivanovii. Данный вид является одним из патогенных для человека видов.

В образце ОСВ Listeriaivanovii присутствовала в количестве 100 КОЕ/г. Полученный результат можно считать значительным, принимая во внимание, что данный микроб относится к патогенным для человека, а ГОСТ Р 17.4.3.07-2001 предполагает отсутствие патогенной флоры в 1 г ОСВ. Данный вопрос требует дальнейшего изучения.

Выводы. Микробиологический состав осадков сточных вод Березовского сыродельного комбината отличается содержанием большого количества условно-патогенных микроорганизмов из сем. Enterobacteriaceae: E. coli(10⁵-10⁷ КОЕ/г),К. pneumoniaes. pneumonia(10³-10⁷ КОЕ/г),Citr.freundii(10-10³ КОЕ/Г),ОТГ. diversus(210⁶ КОЕ/^^. cloacae(10 КОЕ/Г),РГ. vulgaris(10²-10⁵ КОЕ/г),Morg. morganii(10³ КОЕ/г); из сем. Staphy-lococcaceae -St. aureus(до 10 КОЕ/г); из рода Listeria - L. ivanovii(10² КОЕ/г), что является препятствием для использования сырого осадка сточных вод Березовского сыродельного комбината в качестве органического удобрения без предварительной обработки. Наиболее простым и экономически выгодным способом обеззараживания ОСВ может служить компостирование по существующим методикам.