+7 (342) 299 99 69

пн-пт с 900 до 1800

logotype

Анаэробная детоксикация белого

Введение. Белый фосфор (Р4) является одним из самых опасных загрязнителей окружающей среды. Данное вещество обладает высокой химической активностью и летучестью, легко воспламеняется (вплоть до самовоспламенения), поражает все системы внутренних органов человека и животных. Хроническое отравление приводит к глубокой инвалидности, затрагивая кальциевый обмен, приводя к разрушению костей, малокровию, поражению печени, сердечно-сосудистой системы, репродуктивной функции [1].

Тем не менее белый фосфор широко применяется в промышленности, поэтому не исключается попадание данного вещества в окружающую среду. Достаточно вспомнить недавнюю экологическую катастрофу на Украине, где в результате железнодорожной аварии 16 июля 2007 года воспламенились цистерны с техническим фосфором [2]. Единственный метод детоксикации белого фосфора, известный в настоящее время, - его окисление до ортофосфорной кислоты раствором медного купороса, но масштабы применения этого метода ограничены из-за высокой стоимости и токсичности медьсодержащих препаратов.

По этой причине приобрели актуальность разработки методов детоксикации, которые можно использовать крупномасштабно, недорогих и без использования токсичных реагентов. Известны попытки применения элементного (белого и красного) фосфора в качестве фосфорного удобрения [3, 4], но без большого успеха. Между тем у элемента фосфора есть уникальное качество: будучи сильнейшим ядом в виде простого вещества, в окисленном состоянии (фосфорная кислота и ее производные) он абсолютно необходим для всех форм жизни, являясь биогенным макроэлементом.

Таким образом, возможна его полная детоксикация и превращение в полноценное фосфорное удобрение, попытка осуществить которую была предпринята в недавних работах [5-7]. Биодеградация является одним из наиболее популярных и часто применяемых на практике методов обезвреживания промышленных, бытовых и сельскохозяйственных стоков [8]. Целью проведенного нами исследования являлась переработка белого фосфора при помощи микроорганизмов, населяющих осадки канализационных стоков.

Материалы и методы исследования. Состав субстрата, условия анаэробной переработки, кинетика выделения и изменения состава газа, газовая хроматография и спектроскопия 31Р ЯМР описаны в работе [5].

Микробиологический посев. Производился после окончания анаэробной переработки из субстрата с исходным содержанием белого фосфора 0.1% на кафедре биохимии К(П)ФУ. Питательная среда МПА. Разведение образцов производилось в серии из 10 пробирок. Посев производился из концентраций 10-, 10-, 10-, в трёх повторах.

Посевы «газоном» производили под плотной питательной средой в чашке Петри. Инкубация продолжалась 72 часа (температура 35°С), наблюдался равномерный сплошной рост бактерий с разделением их на колонии. Идентификацию выделенных бактериальных культур проводили путём изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, присущих каждому виду. Проводилось окрашивание препаратов по Граму. Использовался световой микроскоп Carl Zeiss Axio с компьютерным интерфейсом, увеличение в 1000 раз.

Посев из субстрата с исходным содержанием белого фосфора 0.01% производился в виварии ИОФХ им. А.Е. Арбузова. Для выделения чистых культур актиномицетов использовали крахмало-аммиачный агар (КАА). Фрагменты колоний из исследуемых проб с помощью иглы переносили на пластинки КАА в чашках Петри. Через 2-3 суток при 25оС на поверхности среды вырастали колонии актиномицетов.

Результаты исследования и их обсуждение. Зависимость кинетики газообразования и метаногенеза от концентрации белого фосфора. При содержании белого фосфора в растворе порядка 0.1% наблюдалось длительное угнетение жизнедеятельности микрофлоры, выражающееся в снижении выделения газообразных продуктов жизнедеятельности по сравнению с контролем, вплоть до временного прекращения выделения газа [5]. Тем не менее даже при такой концентрации токсичного вещества не наблюдалась полная гибель микроорганизмов.

При содержании белого фосфора в иле 0.01% наблюдалось значительное угнетение, вплоть до полного прекращения выделения газа, в течение 2-3 недель, причем угнетение наблюдалось не в начале эксперимента, а спустя приблизительно месяц (рис. 1, С1, С2). При содержании белого фосфора в субстрате 0.001%, наблюдалось незначительное угнетение жизнедеятельности микрофлоры без перерыва в выделении газа, указывающее на устойчивость природных популяций микроорганизмов активного ила к Р4 при разбавлении до указанной концентрации (рис. 1, В1, В2).

После периода угнетения жизнедеятельность микрофлоры, выраженная через выделение и состав газообразных продуктов метаболизма, начинала восстанавливаться (рис. 1, С1, С2). На содержание углекислого газа белый фосфор оказывал менее заметное угнетающее воздействие, чем на содержание метана. Из этого следует, что метаногенные архебактерии более чувствительны к отравлению этим веществом по сравнению с другими представителями микрофлоры активного ила.

Зависимость кинетики выделения газа от концентрации белого фосфора в субстратах
Рис. 1. Зависимость кинетики выделения газа от концентрации белого фосфора в субстратах (ОГ -объем газа, мл, 1111 - продолжительность процесса, дни). Зависимость кинетики изменения соотношения метана и СО2 в газе от концентрации белого фосфора в субстратах. Режим мезофильный

Продолжительность детоксикации белым фосфором. Из субстратов с концентрацией P4 0.01% (мезофильный и термофильный) первая проба для ЯМР-анализа была взята на 35-й день. Спектры продемонстрировали наличие одного сигнала, соответствующего белому фосфору (рис. 2). Значит, вне зависимости от режима термо-статирования срок в 35 дней недостаточен для переработки P4 активным илом.

-3>' ■'<• „Л ■'>' v,w ':,и -W -W ІЛІ -Лі -W -W :ЛІ -Лі '-Ні -Лі

Изменение интенсивности сигнала белого фосфора в спектрах ЯМР в зависимости от продолжительности процесса анаэробной переработки
Рис. 2. Изменение интенсивности сигнала белого фосфора в спектрах ЯМР в зависимости от продолжительности процесса анаэробной переработки. Режим мезофильный. На 35 день эксперимента (слева) сигнал белого фосфора четко различим, на 63 день (справа) спектр не содержит сигналы

Вторая проба из субстрата с концентрацией белого фосфора 0.01% (мезофиль-ный) была отобрана на 63-й день. Проба отбиралась из другой повторности опыта, чтобы исключить влияние на процесс предыдущего отбора пробы. Спектр показал отсутствие сигналов фосфорных соединений, в том числе белого фосфора. Следует отметить, что вторая проба была отобрана на фоне резкой активации процесса выделения газа субстратом. Таким образом, срок продолжительностью 63 суток оказался достаточным для переработки белого фосфора в концентрации 0.01%. Отсутствие соединений фосфора в эфире косвенно свидетельствует о метаболизме Р4 в водорастворимые соединения, не экстрагируемые эфиром, т.е. об его окислении. В таком случае период угнетения жизнедеятельности микроорганизмов, наблюдавшийся во всех экспериментах, вероятнее всего, обусловлен накоплением токсичных для бактерий ги-пофосфитов. Дальнейшее возобновление активного метаболизма связано с последующим окислением гипофосфит-ионов до нетоксичных фосфитов и фосфатов. Температурный режим процесса не играл существенной роли. Предположительно, адаптация микрофлоры активного ила к присутствию Р4 и его метаболизм осуществляются именно в период угнетения жизнедеятельности. Соответственно не играло роли и агрегатное состояние Р4.

На поверхности субстратов с добавлением белого фосфора 0.01% наблюдался рост колоний микроорганизмов, которые по внешним признакам идентифицировали как актиномицеты. С целью определения видовой принадлежности и дальнейшего получения накопительных культур произвели посев на культуральную среду (см. Материалы и методы). Выращенные микроорганизмы были идентифицированы как представители рода 8Ггертошусе8 (рис. 3).

Колонии актиномицетов на крахмал-аммиачной среде в опыте с содержанием белого фосфора
Рис. 3. Колонии актиномицетов на крахмал-аммиачной среде в опыте с содержанием белого фосфора 0.01% масс.

При одинаковом разведении из опытного (с белым фосфором) субстрата с содержанием белого фосфора 0.1%, выросло больше колоний бактерий, чем из контрольного (табл. 1).

Исходя из приведенных в таблице данных, плотность клеточной суспензии в контроле составляла 2.5 -10 8 клеток / мл субстрата, а в опыте - 1.5 -10 10 клеток/мл субстрата, т.е. на два порядка больше. Судя по морфологии колоний (одинаковый размер, структура поверхности, цвет), все они принадлежат одному виду грамположительных бактерий (рис. 4). Вероятно, это связано со спецификой культуральной среды, на которой растут не все виды бактерий.

Таблица 1. Количество колоний бактерий, выросших из опытного и контрольного субстратов при двух разведениях

Субстрат

Разведение

 

10 7

10 8

Опыт

56

76

70 21

26

21

Контроль

5

0

1 0

1

0

Колонии анаэробных бактерий под МПА в опыте с содержанием белого фосфора
Рис. 4. Колонии анаэробных бактерий под МПА в опыте с содержанием белого фосфора 0.1% масс. (слева) и в контроле (справа) , выращенные на кафедре биохимии КФУ. Разведение 10-7

Следует подчеркнуть, что в контрольных субстратах (без белого фосфора) рост колоний не наблюдался. Отсутствие роста микроорганизмов в контрольныгх субстратах после прекращения выделения газа кажется парадоксальным (получается, что в присутствии токсичного ксенобиотика микроорганизмы лучше растут по сравнению с контролем). Вероятно, это различие вызвано тем, что в контроле исчерпались питательные вещества, и популяция сократилась. В опыте плотность популяции осталась такой же, как в исходном иле, бактерии при этом не погибли, а впали в анабиоз, из которого вышли в благоприятных условиях.

Заключение. Впервые показана возможность деградации белого фосфора под действием осадка сточных вод (ОСВ) водоочистных сооружений. Установлено, что в результате токсического воздействия продуктов разложения белого фосфора происходит угнетение метаногенного процесса деятельности микроорганизмов, а последующая адаптация микрофлоры к действию токсиканта приводит к полной биодеградации и переработке белого фосфора в нетоксичные продукты с сохранением исходной активности.

При использовании ряда аналитических методов, включая метод ядерного магнитного резонанса, установлено, что белый фосфор в концентрации 0.01 и 0.001% в результате контакта с активным илом окисляется до водорастворимых соединений. Нам до сих пор не известны механизм деградации, роль в нем живых микроорганизмов. Однако полученные нами данные по выживаемости микрофлоры свидетельствуют в пользу ее участия в процессе деструкции белого фосфора.

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голосов)
  • Комментарии к статье
  • Вконтакте
  • Facebook

Содержимое второго блока